Premio nobel per la chimica. Proteina fluorescente

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Premio nobel per la chimica. Proteina fluorescente

Post by Mano[FA] » 09/10/2008 15:10

Il recente premio nobel per la chimica e' stato dato a Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien "Per la scoperta e lo sviluppo della GFP, proteina fluorescente verde".

Martin Chalfie e' un "worm person" uno dei primi scienziati ad aver lavorato sul piccolo vermetto (C. elegans) che sto studiando adesso (sto facendo ricerca presso l'universita' di Leeds, Inghilterra). Gia' ben 5 persone che hanno fatto ricerca sul questo vermetto sono state insignite di un premio nobel (scoperte sulla morte cellulare e scoperta RNAi). Il laboratorio con cui collaboro fa intensissimo uso della GFP. Ma che e'? A cosa serve?

la GFP e' una proteina che e' stata trovata in una medusa da Osamu Shimomura. Ha la proprieta' di assorbire luce nello spettro del blu/ultravioletto ed emettere nelle frequenze del verde.
Martin Chalfie e' stato il primo ad utilizzare questa proteina per "illuminare" in maniera selettiva alcune cellule specifiche di C. elegans. In particolare i neuroni.
Roger Y. Tsien ha modificato la GFP per farla diventare gialla o rossa o verde in modo da poter, nello stesso organismo/ordano/tessuto/cellula peter vedere 2 o piu' "cose" alla volta.

Ma per spiegarmi non c'e' niente di meglio che ... un filmato!!

beccatevi questo video e gurdatelo. Poi tornate a leggere qui (ma tenete la pagina aperta perche' lo guarderete piu' e piu' volte)

http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200108051/DC1/3

Quello che vedete e' un filmato accellerato che mostra quello che avviene nei primi 12 minuti dopo che una cellula uovo di C.elegans viene fecondata da uno spermatozoo.
I ricercatori hanno creato un verme "transgenico" inserendo in C. elegans 2 proteine (di C. elegans) fuse alla GFP (che e' una proteina di medusa).
Istoni e la tubulina.
Le cellule di questo verme producono quindi una "versione verde" di proteine che normalmente si trovano in C. elegans e che hanno ovviamente la loro funzione. Gli istoni si legano al DNA, la tubulina e' una proteina che fa da "scheletro" alla cellula e in particolare forma dei "cavi molecolari" che servono a "tirare" i cromosomi durante ogni divisione cellulare.

Per produrre questo filmato e' stata fatta una foto al microscopio ottico ogni sei secondi usando luce bianca (foto sulla sinistra) e subito dopo un'altra foto illuminando con luce ultravioletta ma filtrando per le frequenze verdi. Vista al microscopio la foto sulla destra e' in verde/nero, ma essendo la fotocamera in bianco e nero, cosi' e' l'immagine catturata.

Cosa succede:
Sulla destra della cellula c'e' il nucleo portato dallo spermatozoo ("illuminato" dalla GFP fusa agli istoni), sulla sinistra della cellula il nucleo della cellula uovo. Ciascuno porta due copie IDENTICHE dei 6 cromosomi di C. elegans. I due nuclei pero' hanno diverse "versioni" dei 6 cromosomi. Uno la "versione" materna, uno la "versione" paterna. I cromosomi, pero', non si vedono ancora perche' non sono stati ancora "impachettati".
I due piccoli puntini vicino al nucleo dello speratozoo sono i centrioli ("illuminati" dalla GFP fusa alla tubulina)

A questo punto i due nuclei si avvicinano, il DNA si compatta in cromosomi (che iniziano a diventar visibili), la membrana nucleare si dissolve, i cromosomi si allineano sul fuso mitotico, i centrioli creano i ponti con i "cavi" di tubulina e poi iniziano a tirare separandosi. Ogni centriolo porta con se una copia materna e una copia paterna creando cosi' due cellule identiche e con una combinazione "nuova".

Verso la fine si vede che anche la cellula si sta dividendo, crenado una membrana che divida i due nuclei. Attorno ai nuclei si riformera' la membrana nucleare e i cromosomi si "spacchetteranno" per essere accessibili al sistema di trascrizione e duplicazione.

Ora riguradatevelo tutte le volte che volete, magari mettendo in pausa ogni tanto.


Alcune chiarificazioni.
- L'uovo e' lungo circa 20-30 micron cioe' 0.02-0.03 millimetri
- C. elegan e' generalmente nella forma ermafrodita quindi lo stesso individuo produce sia spermatozoi che uova. Questo ha importanti implicazioni che rendono piu' semplice studiarlo (tutti i vermi sono geneticamente esattamente uguali). Quindi i cromosomi materni e paterni sono identici (ma nella maggior parte degli animali, in cui avviene praticamente la stessa cosa i cromosomi sono diversi, come ho descritto sopra)

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Post by Lysor_o.O » 09/10/2008 22:23

Quindi, se ho capito bene, la scoperta di questi premi Nobel ha permesso di ottenere la metà di destra del video? Il che significa che anziché doverci limitare a guardare il tutto da fuori, possiamo vedere chiaramente che cosa succede dentro?

...C'è qualcosa che mi sfugge: la luce ultravioletta e quella verde passano attraverso l'uovo. Questo significa che l'uovo è trasparente? Altrimenti come farebbe la luce a entrare e uscire? Ma se è trasparente, perché nella parte di sinistra del video sembra opaco?
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Tu vedi delle cose e chiedi: perché? Ma io sogno di cose che non ci sono mai state, e che forse non ci saranno mai, e dico: perché no?
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Post by CuginoIt » 09/10/2008 23:04

Beh, ciò che è trasparente ad alcune frequenze non lo è ad altre... In genere più le frequenze sono alte più riescono ad essere trasmesse nei vari materiali...
Una cosa che mi ha sempre colpito è la seguente. Vi siete mai chiesti perchè le frequenze che il nostro occhio vede sono proprio quelle e non altre. Cosa distingue le frequenze visibili da quelle non visibili?
La risposta è l'acqua! Le frequenze visibili sono quelle per le quali l'acqua è trasparente: fuori da quelle frequenze l'acqua diventa sempre più opaca... E' quindi pensabile che i primi "occhi" si siano formati, evolutivamente parlando, per favorire la visione dei pesci nell'acqua.... altre frequenze sarebbero state inutili.
Per quanto riguarda microscopi (ma anche osservazioni astronomiche) si possono usare filtri adeguati per visualizzare solo le frequenze di interesse.
Per i microscopi ottici infine è molto importante la messa a fuoco: cambiando messa a fuoco si riescono a vedere cose su "piani diversi"... almeno, mi sembra di ricordare così, ma è tanto che non guardo in un microsopio :D

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Post by Mano[FA] » 09/10/2008 23:44

Lysor_o.O wrote:Quindi, se ho capito bene, la scoperta di questi premi Nobel ha permesso di ottenere la metà di destra del video? Il che significa che anziché doverci limitare a guardare il tutto da fuori, possiamo vedere chiaramente che cosa succede dentro?
Più che una questione di "dentro e fuori" è proprio una questione di vedere o non vedere. La tubulina (del filmato di cui sopra) non ha colore, ed è praticamente indistinguibile da tutto il resto. Peggio ancora una proteina di membrana (ce ne sono centinaia, quella che studio io si trova nella cellula uovo? O viene sintetizzata solo nelle cellule neuronali differenziate?).
Poi la GFP è intensamente usata come strumento per altre ricerche (non per vedere una proteina, ma per colorare cellule di interesse)

Per esempio in questa Immagine (presa da questo sito):
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Sono stati "Illuminati" alcuni neuroni (i pallini verdi con i processi - assoni - che si collegano ad altrin neuroni e ai muscoli). Un mio collega "illumina" neuroni particolari e poi con un laser... zap! Li brucia. E poi vediamo se si muove ancora :)

Il vermetto è trasparente. Quindi lo è anche l'uovo. L'immagine di sinistra del video del primo post "sembra" opaca perchè usano una tecnica particolare che permette di "ombreggiare" zone con diversa intensità (lipidi...). Se fosse davvero opaco (come un sassolino) sarebbe tutto NERO.

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Post by Lysor_o.O » 10/10/2008 00:41

Ok, ora ho capito. Grazie! Certo però che siete veramente bastardi... Prendete un cosino indifeso lungo 1 mm e gli bruciate i muscoli con un laser... Ah, se vi scoprisse il WWF... :laugh:

...Interessante la cosa dell'acqua, QG, non ci avevo mai pensato, nemmeno lontanamente!
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Post by Mano[FA] » 10/10/2008 10:48

Lysor_o.O wrote:...Interessante la cosa dell'acqua, QG, non ci avevo mai pensato, nemmeno lontanamente!
A me avevano detto che le frequenze visibili hanno un ottimo overlap con quelle emesse dal sole. In particolare che il nostro occhio e' particolarmente sensibile al giallo (un giallo appena appena non giallo ci risulta subito "sporco" mentre un ampio intervallo di lunghezze d'onda ci appaiono "rosse" o "blu"). Mi pare vi siano alcuni animali (insetti?) che vedono anche l'ultravioletto.

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